Descripción de las líneas de investigación desarrolladas en los últimos años

El grupo estudia procesos de regulación de la proliferación y diferenciación celular mediados por moléculas derivadas de los aminoácidos, en concreto hormonas peptídicas de la familia de las melanocortinas como ejemplo de mensajeros intercelulares por una parte, y poliaminas como reguladores intracelulares por otra. Las líneas de investigación en las que viene trabajando el grupo son las siguientes:

• 1. Señalización intercelular por melanocortinas
  Analizamos la función del receptor de melanocortinas 1 (MC1R), con énfasis en el efecto de mutaciones naturales en las propiedades de señalización, el tráfico intracelular y el aumento del riesgo de cáncer de piel. A continuación resumimos algunos de nuestros resultados.
  • 1.1- Caracterización funcional de variantes del MC1R asociadas a melanoma
    Hemos jugado un papel importante en la elucidación de las propiedades funcionales y del procesamiento de MC1R normal y sus variantes asociadas a melanoma. Demostramos que la pérdida de función de alelos de riesgo se debe a menudo a anomalías en el tráfico anterógrado. También mostramos que la activación de las kinasas ERK1 y ERK2 por MC1R es un proceso independiente de AMPc mediado por la transactivación de cKIT, y es mucho menos sensible a las mutaciones del tipo RHC que la cascada del AMPc.
  • 1.2- Regulación de la señalización por MC1R
    Estudiamos la represión de MC1R por estrés oxidativo, mediada por una disminución de los niveles del factor de transcripción MITF. Describimos la regulación de MC1R por desensibilización homóloga, la implicación de kinasas específicas como GRK2 y GRK6, y el papel de arrestinas. Hemos descubierto un nuevo mecanismo de regulación basado en el desplazamiento de la subunidad α de la proteína Gs por la E3 ubiquitina ligasa MGRN1.
• Poliaminas en procesos de crecimiento y diferenciación celular
  El equipo tiene amplia experiencia en la Bioquímica, Biología Molecular y Fisiología de las poliaminas y de las proteínas relacionadas con su metabolismo, y en especial con ornitina descarboxilasa (ODC), enzima que cataliza la síntesis de putrescina, etapa limitante del proceso biosintético de las poliaminas, así como con sus proteínas reguladoras, las antizimas (AZs) y proteínas inhibidoras de las antizimas (AZINs). Tanto ODC como sus proteínas reguladoras están relacionadas con procesos de crecimiento y diferenciación celular, en especial con el cáncer, y se consideran dianas de agentes antineoplásicos. A continuación se resumen algunos de nuestros resultados.
  • 2.1- Aspectos estructurales y funcionales de ODC Caracterizamos nuevos residuos de ODC implicados en su actividad catalítica y su degradación por el proteasoma. Se ha puesto de manifiesto que el pico preovulatorio de actividad ODC es crítico para que el cuerpo lúteo adquiera la capacidad secretora de progesterona. También demostramos que el aumento de ODC en el embrión de ratón en el día 8 de gestación es crítico para el desarrollo de la actividad hematopoyética del saco vitelino y el comienzo de la actividad esteroidogénica de la placenta, y que las poliaminas sintetizadas en la placenta sustentan el crecimiento fetal. Recientemente describimos la interdependencia de la vía del AMPc/PKA con la apertura de canales de calcio, como señales esenciales para la inducción de ODC cardiaca, que podría relacionarse con procesos de hipertrofia cardiaca.
  • 2.2- Estructura y función de ODCp/AZIN2
    Nuestro grupo demostró que un gen parálogo de ODC, denominado ODCp es una proteína inhibidora de antizimas, a la que denominamos AZIN2. Esta proteína es un regulador positivo de los niveles intracelulares de poliaminas a través de sus acciones sobre la biosíntesis y la captación de poliaminas. Dicha proteína se expresa entre otros tejidos en cerebro y testículo, estando en este último implicada en el proceso de espermiogénesis. Recientemente, hemos generado ratones hipomorfos de AZIN2, con determinadas alteraciones neurológicas y reproductoras, que están sirviendo de modelo para dilucidar la función fisiológica de dicha proteína

Identificación de las líneas de investigación a desarrollar en los próximos años

1. Señalización intercelular por melanocortinas
El MC1R expresado en melanocitos epidérmicos es el principal determinante del fototipo cutáneo. Juega un papel esencial en las respuestas de adaptación a la radiación ultravioleta. Variantes del gen MC1R se asocian a melanoma (MM), el 5º tumor sólido más frecuente que causa 80% de las muertes por cáncer de piel. Las variantes de alta penetrancia más frecuentes asociadas a MM codifican proteínas con acoplamiento funcional disminuido a la vía del AMPc, pero se desconocen las propiedades de muchos alelos variantes, así como de formas de corte-empalme intergénico inducidas por UVR. En particular, no comprendemos bien las diferencias funcionales que expliquen la menor penetrancia de alelos “r” en comparación con formas “R” de mayor penetrancia. Creemos que una comparación funcional exhaustiva de formas “R” y “r”, de variantes más raras y de isoformas de corte-empalme intergénico inducidas por UVR mejorará la comprensión de la base molecular de la asociación MC1R-cáncer de piel, y podría permitir una estimación del impacto en el riesgo de cáncer piel de variantes poco frecuentes para las que no hay datos de epidemiología genética. Por otra parte, MC1R está estrechamente regulado por mecanismos generales comunes para los GPCRs, como la desensibilización mediada por arrestinas (ARRBs), y por mecanismos específicos de la subfamilia de los MCR, como la inhibición por MGRN1. Estos mecanismos podrían cooperar en el control de la pigmentación basal e inducida por UVR. Su estudio proporcionará nuevos datos acerca de la regulación de la pigmentación humana y en relación con los mecanismos protectores dependientes de MC1R pero independientes de pigmentación. El grupo va a abordar las siguientes líneas en los próximos años:

1. Caracterización de variantes y formas de corte-empalme del MC1R
   • Comparación directa de las propiedades funcionales de variantes “r” y “R”
   • Estudio de las propiedades funcionales de isoformas de corte-empalme intergénico MC1R-TUBB3 inducidas por UVR
2. ii. Análisis de los mecanismos de regulación funcional del MC1R
   • Implicación de ARRB1 y ARRB2 en la desensibilización de MC1R
   • Señalización no canónica de MC1R dependiente de MGRN1 o
   • Análisis de interacciones funcionales de ARRBs y MGRN1

2. Poliaminas en procesos de crecimiento y diferenciación celular
 

El principal objetivo se centra en dilucidar la relevancia fisiológica de AZIN2 mediante el estudio de ratones KO de dicho gen y avanzar en el conocimiento de la estructura, propiedades y funciones moleculares y fisiológicas de AZIN2 y sus posibles implicaciones patológicas. Los objetivos concretos serían:

• i. Caracterización fenotípica de ratones Azin2 -/-, analizando posibles alteraciones en la fisiología testicular, adrenal o cerebral, y su repercusión en los niveles de poliaminas en estos tejidos, así como en los niveles plasmáticos y tisulares de testosterona, corticosterona y catecolaminas. Se profundizará en el estudio de los tejidos o sistemas más afectados mediante los procedimientos más convenientes en cada caso, valorando realizar cruces con otros modelos transgénicos existentes, y en especial con el KO de AZ3.
• ii. Comparar el patrón de expresión de AZIN2 en testículo, cerebro y adrenales de ratones wt y heterocigotos (Azin2 +/-),
• iii. Analizar los cambios en la expresión de ARNm en testículo de ratones knock-out de AZIN2 con relación a controles, mediante microarrays y posterior validación por RT-PCR a tiempo real.
• iv. Comparar la expresión temporal de AZIN2 y AZ3 en testículo de ratón y rata, mediante RTPCR cuantitativa, y determinar mediante análisis de Northern la existencia de splicing alternativos de AZIN2 en testículo y cerebro de ratón y rata y compararlos con los descritos para AZIN2 humana.
• v. Determinar las características estructurales de AZIN2 relacionadas con su interacción con AZ3, mediante experimentos de transfección con Azin2-Flag y cotransfección con AZ3-HA en células HEK293, coinmunoprecipitación y microscopía confocal, así como la influencia de la concentración de poliaminas en los niveles de AZ3 y AZIN2, vida media de estas proteínas y posibles cambios en su localización intracelular.
• vi. Determinar el papel de AZIN2 en la captación de agmatina e identificar por análisis proteómico potenciales nuevas dianas de AZIN2 o AZ3 que pudieran ayudar a comprender los mecanismos de acción de nuestras proteínas.